一、引言

桔青霉素（Citrinin，CIT）是一種由青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）某些菌株產生的真菌毒素，廣泛存在于小麥、裸麥、大麥、燕麥等農作物中。研究表明，桔青霉素對哺乳動物具有腎臟毒性，可造成腎臟、肝臟、腸道和生殖系統的損傷。2017年，世界衛生組織國際癌癥研究機構將其列入3類致癌物清單。紅曲霉在產生紅曲色素等有益代謝產物的同時，部分菌株也會產生桔青霉素，引發了人們對紅曲產品安全性的關注。

為保障食品安全，我國于2016年發布了GB 5009.222-2016《食品安全國家標準 食品中桔青霉素的測定》-。該標準代替了GB/T 5009.222—2008《紅曲類產品中桔青霉素的測定》、SN/T 2426—2010《進出口糧谷中桔霉素含量檢測方法 液相色譜法》和SN/T 2916—2011《出口食品中桔霉素的測定方法 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》。與舊版標準相比，主要變化包括：標準名稱修改為“食品安全國家標準 食品中桔青霉素的測定"、增加了凈化步驟、擴大了適用范圍。本文對該標準的技術要點進行系統解讀。

二、標準適用范圍

GB 5009.222-2016規定了食品中桔青霉素的測定方法，包含兩種方法：

·         第一法（免疫親和柱凈化-高效液相色譜法） ：適用于大米、玉米、辣椒、紅曲類產品中桔青霉素的測定。

·         第二法（C??固相萃取小柱凈化-高效液相色譜法） ：適用于大米、大麥、燕麥、小麥中桔青霉素的測定。

三、第一法：免疫親和柱凈化-高效液相色譜法

3.1 方法原理

試樣中的桔青霉素用甲醇-水提取，提取液經過濾、稀釋后，用桔青霉素免疫親和柱凈化。免疫親和柱內鍵合有桔青霉素的特異性抗體，樣品通過時桔青霉素被抗體選擇性吸附，雜質則隨淋洗液流出-。隨后用洗脫液使抗體變性，將桔青霉素從親和柱上洗脫下來。凈化后的樣品采用液相色譜結合熒光檢測器測定，外標法定量。

3.2 關鍵試劑與配制

標準對試劑的純度有明確要求：甲醇、乙腈、磷酸、冰乙酸均為色譜純。水為GB 6682規定的二級水。主要試劑配制包括：

·         磷酸溶液（10 mmol/L，pH 7.5） ：移取1.376 mL磷酸加水定容至2000 mL，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.5。

·         磷酸溶液（10 mmol/L，pH 2.5） ：同樣配制后用氫氧化鈉調節pH至2.5。

·         PBS緩沖溶液（pH 7.0） ：稱取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀，用水溶解定容至1000 mL。

·         0.1%吐溫20-PBS溶液：移取1 mL吐溫20以PBS緩沖溶液定容至1000 mL。

·         洗脫液I：甲醇-10 mmol/L磷酸溶液（pH 2.5）（70+30）。

·         洗脫液Ⅱ：甲醇-0.1%磷酸溶液（70+30）。

標準品桔青霉素（C??H??O?，CAS號：518-75-2）純度要求≥99.0%。標準儲備液濃度為100 μg/mL，于4℃下保存。

3.3 樣品前處理

大米、玉米、辣椒：稱取粉碎試樣10.0 g，加入50 mL甲醇-水（70+30）提取液，高速均質提取2 min。取1.0 mL濾液，加入49 mL 10 mmol/L磷酸溶液（pH 7.5）稀釋，玻璃纖維濾紙過濾后待凈化。

紅曲及其制品：稱取試樣1.0 g，加入20 mL甲醇-水（70+30）提取液，高速均質提取2 min。取1.0 mL濾液，加入39 mL PBS緩沖溶液稀釋。

3.4 凈化

大米、玉米、辣椒：取10.0 mL稀釋濾液（相當于0.04 g試樣）過桔青霉素免疫親和柱，流速1～2滴/秒。用5 mL 10 mmol/L磷酸（pH 7.5）淋洗后，用1.0 mL洗脫液I洗脫，收集洗脫液供檢測。

紅曲及其制品：取10.0 mL稀釋濾液過柱，用10 mL 0.1%吐溫20-PBS溶液淋洗后，用1.0 mL洗脫液Ⅱ洗脫。

3.5 液相色譜條件

大米、玉米、辣椒：C??色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進樣量50 μL；激發波長350 nm，發射波長500 nm；流動相A為乙腈，B為10 mmol/L磷酸（pH 2.5），采用梯度洗脫。

紅曲及其制品：C??色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，流速0.7 mL/min，進樣量50 μL；檢測波長同上；流動相A為乙腈，B為0.1%磷酸，梯度洗脫。

3.6 定量與性能指標

采用外標法定量，配制0.0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL共6個濃度的基質標準工作液制作標準曲線。

方法檢出限和定量限因基質而異：大米、玉米、辣椒的檢出限為8 μg/kg，定量限為25 μg/kg；紅曲及其制品的檢出限為25 μg/kg，定量限為80 μg/kg。在重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

四、第二法：C??固相萃取小柱凈化-高效液相色譜法

4.1 方法原理

用乙腈-異丙醇-水的混合溶液提取試樣中的桔青霉素，經C??固相萃取小柱凈化后，用配備熒光檢測器的液相色譜儀測定，外標法定量。

4.2 關鍵試劑與前處理

提取溶劑為乙腈-異丙醇-水（35+10+55），用磷酸調pH至1.5。流動相為乙腈-異丙醇-磷酸溶液（0.08 mol/L）（35+10+55）。

樣品經粉碎過830 μm篩后，稱取約5 g，加10 mL提取溶劑振蕩提取30 min，3500 r/min離心4 min。殘渣中再加5 mL提取溶劑重復提取，合并上清液，加水至40 mL并用磷酸調pH至1.5。

4.3 凈化與測定

提取液過預淋洗好的C??固相萃取柱，用5 mL水淋洗，減壓抽干3 min后，用10 mL甲醇以1.0 mL/min速度洗脫。洗脫液在40℃下氮吹至干，以1.0 mL流動相溶解，過0.22 μm濾膜后供液相色譜測定。

色譜條件：C??柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫28℃，流速1.0 mL/min，進樣量50 μL；激發波長331 nm，發射波長500 nm。桔青霉素保留時間約為9.1 min。

4.4 性能指標

第二法的檢出限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg，靈敏度優于第一法。精密度要求與第一法相同。

五、兩法對比與選用建議

第一法采用免疫親和柱凈化，特異性強、凈化效果優異，特別適合紅曲類等基質復雜的樣品。第二法采用C??固相萃取，操作相對簡便、成本較低，靈敏度更高，適合谷物類樣品的日常檢測。實驗室可根據樣品類型和檢測需求選擇合適的方法。

六、結語

GB 5009.222-2016作為食品中桔青霉素檢測的強制性國家標準，整合了原有的多項行業標準，建立了以高效液相色譜-熒光檢測法為核心、兩種前處理方案并行的技術體系。該標準的實施為監管部門、食品生產企業及檢測機構提供了統一、規范的技術依據，對保障食品安全、控制紅曲類產品及谷物中桔青霉素污染風險具有重要意義。