一、標(biāo)準(zhǔn)概述

GB 31658.6-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中四環(huán)素類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》是由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國家衛(wèi)生健康委員會、國家市場監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草，系首次發(fā)布。標(biāo)準(zhǔn)于2021年9月16日發(fā)布，2022年2月1日正式實(shí)施，全文共12頁。

該標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布，為動物性食品中四環(huán)素類藥物殘留的檢測提供了統(tǒng)一、規(guī)范的技術(shù)依據(jù)，對于保障食品安全、加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控具有重要意義。

二、制定背景

四環(huán)素類藥物（包括土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素等）具有抗菌譜廣、價格低廉的優(yōu)點(diǎn)，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛用作飼料添加劑，以防治疾病和促進(jìn)生長。然而，這類藥物在動物體內(nèi)易產(chǎn)生累積和殘留。

四環(huán)素類藥物對人體的危害不容忽視。它們易與人體中的鈣結(jié)合，沉積于骨骼和牙齒中，抑制骨骼和牙齒的生長發(fā)育，尤其對胎兒和嬰幼兒影響較大，可導(dǎo)致牙齒持久染色變黃；此外，還可在肝臟中沉積，長期累積會造成肝臟和腎臟的損傷。鑒于其健康風(fēng)險，國家對動物源性食品中的四環(huán)素類藥物殘留限量有嚴(yán)格的規(guī)定，配套的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》。GB 31658.6-2021正是為配合限量標(biāo)準(zhǔn)的執(zhí)行而制定的配套檢測方法標(biāo)準(zhǔn)。

三、適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬、牛、羊、雞的肌肉、肝臟和腎臟，豬、雞的皮+脂肪，雞蛋，牛奶，魚皮+肉，蝦肌肉中四種四環(huán)素類藥物殘留量的檢測，具體目標(biāo)物包括：

·         土霉素（Oxytetracycline）

·         四環(huán)素（Tetracycline）

·         金霉素（Chlortetracycline）

·         多西環(huán)素（Doxycycline，又稱強(qiáng)力霉素）

該標(biāo)準(zhǔn)覆蓋了動物性食品的主要品類和養(yǎng)殖動物種類，具有較強(qiáng)的普適性。

四、檢測原理與方法

4.1 方法總覽

本標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）作為核心檢測手段。檢測流程主要包括樣品制備、提取、固相萃取凈化、液相色譜分離、紫外檢測器檢測、外標(biāo)法定量等環(huán)節(jié)。

4.2 樣品前處理

樣品前處理是四環(huán)素類藥物殘留檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于動物性食品基質(zhì)復(fù)雜（含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等干擾物），必須經(jīng)過充分的提取和凈化才能獲得可靠的檢測結(jié)果。

（1）提取

試樣經(jīng)均質(zhì)后，采用乙二胺四乙酸二鈉（EDTA·2Na）-McIlvaine緩沖溶液進(jìn)行提取。EDTA的加入可與金屬離子形成絡(luò)合物，防止四環(huán)素類藥物與金屬離子螯合而影響提取效率。提取液經(jīng)離心后取上清液待凈化。

（2）固相萃取凈化

標(biāo)準(zhǔn)采用兩級固相萃取（SPE）凈化策略，即使用反相聚合物小柱（如PEP-2、HLB等）和磷酸化聚苯乙烯二乙烯苯高聚物小柱（如LCX）配合使用，以實(shí)現(xiàn)動物源性樣品的深度凈化。

具體凈化流程為：提取液先經(jīng)反相聚合物小柱凈化，用甲醇洗脫目標(biāo)化合物；洗脫液經(jīng)適當(dāng)處理后，再上樣至LCX固相萃取柱進(jìn)行二次凈化。LCX固相萃取柱的磷酸官能團(tuán)可通過離子交換作用特異性吸附四環(huán)素類藥物。最后用草酸乙腈溶液洗脫，收集洗脫液后經(jīng)氮?dú)獯蹈伞⒍ㄈ荨⑦^濾，即可上機(jī)檢測。

值得注意的是，四環(huán)素類藥物對熱不穩(wěn)定、見光易分解。因此，在前處理過程中應(yīng)注意避光操作，氮吹溫度一般控制在40℃以下。制備好的上機(jī)溶液應(yīng)在24小時內(nèi)完成測定。

4.3 液相色譜條件

色譜柱：采用反相C18色譜柱，常用規(guī)格為4.6×150 mm，5 μm。

流動相：乙腈與0.01 mol/L草酸溶液的混合溶液，典型比例為25:75（v/v）。草酸的加入有助于改善四環(huán)素類藥物的色譜峰形，減少拖尾。

檢測波長：紫外檢測器，檢測波長為350 nm或365 nm。

流速：1.0 mL/min。

柱溫：30℃。

進(jìn)樣體積：50 μL。

4.4 定量方法

采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。將待測樣品的色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積進(jìn)行比較，計算樣品中四種四環(huán)素類藥物的殘留量。

五、方法學(xué)性能指標(biāo)

5.1 線性范圍與相關(guān)系數(shù)

在0.05~5 μg/mL濃度范圍內(nèi)，土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的線性相關(guān)系數(shù)R2均≥0.9994，表明該方法在較寬的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

5.2 檢出限與定量限

方法的檢出限（LOD）可低至0.5 μg/kg級別，定量限（LOQ）可達(dá)1.5 μg/kg。不同基質(zhì)和不同藥物可能略有差異，但整體靈敏度較高，完全能夠滿足殘留監(jiān)控的需求。

以土霉素為例，方法檢出限可低至12 μg/kg，遠(yuǎn)低于GB 31650中規(guī)定的限量值（土霉素40 μg/kg、四環(huán)素100 μg/kg）。

5.3 回收率與精密度

方法在添加濃度0.4 mg/kg（400 μg/kg）水平下，基質(zhì)加標(biāo)回收率可達(dá)85%以上。10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣5針，峰面積RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

六、檢測關(guān)鍵點(diǎn)與注意事項(xiàng)

6.1 四環(huán)素類藥物的化學(xué)不穩(wěn)定性

四環(huán)素類化合物在不同pH條件下以不同形態(tài)存在：

·         pH＜2時，以脫水四環(huán)素類形式存在；

·         2＜pH＜6時，以差向四環(huán)素類形式存在；

·         pH＞9時，會發(fā)生內(nèi)酯化現(xiàn)象。

因此，在整個檢測過程中嚴(yán)格控制溶液的pH值至關(guān)重要。

此外，四環(huán)素類藥物熱穩(wěn)定性較差、見光易分解。建議標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）在-18℃以下避光保存，有效期1個月；混合標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

6.2 固相萃取環(huán)節(jié)的優(yōu)化

在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)中固相萃取步驟可能存在回收率不理想的情況。主要原因有兩方面：

一是上樣液有機(jī)相比例過大，洗脫能力太強(qiáng)，導(dǎo)致目標(biāo)物在LCX固相萃取柱上吸附不充分；二是四環(huán)素類抗生素離子化不充分，與LCX固相萃取柱磷酸官能團(tuán)的結(jié)合效率低。

針對這些問題，可采取以下優(yōu)化措施：

·         將甲醇洗脫液中的2 mL水替換為2 mL 8 mM磷酸二氫鈉水溶液（pH 5.0） ，通過調(diào)節(jié)pH增強(qiáng)填料對藥物的吸附效率；

·         最后定容時直接用草酸溶液（0.01 M） 定容至2 mL，消除溶劑效應(yīng)。

6.3 與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的銜接

GB 31658.6-2021是GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》的配套檢測方法標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)際檢測中，應(yīng)根據(jù)GB 31650規(guī)定的限量值進(jìn)行結(jié)果判定。例如，羊肝、腎組織中四環(huán)素類藥物的限量值均為100 μg/kg。

此外，四環(huán)素類藥物殘留還可采用GB 31658.17-2021（同時測定四環(huán)素類、磺胺類和喹啉酮類）等其他標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)具體檢測需求和儀器配置選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?/span>

七、總結(jié)

GB 31658.6-2021作為動物性食品中四環(huán)素類藥物殘留檢測的專項(xiàng)國家標(biāo)準(zhǔn)，具有以下突出特點(diǎn)：

一是覆蓋面廣。涵蓋了豬、牛、羊、雞、魚、蝦等多種動物源食品以及肌肉、肝臟、腎臟、脂肪、雞蛋、牛奶等多種基質(zhì)。

二是目標(biāo)物明確。針對土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素四種最常用的四環(huán)素類藥物進(jìn)行檢測。

三是方法可靠。采用高效液相色譜法配合兩級固相萃取凈化，靈敏度高、重現(xiàn)性好，方法學(xué)指標(biāo)滿足殘留監(jiān)控要求。

四是可操作性強(qiáng)。標(biāo)準(zhǔn)對樣品制備、提取、凈化、色譜條件等各環(huán)節(jié)均有明確規(guī)定，便于實(shí)驗(yàn)室實(shí)施。

該標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施，為監(jiān)管部門開展獸藥殘留監(jiān)測、保障動物性食品安全提供了有力的技術(shù)支撐，也為相關(guān)檢測實(shí)驗(yàn)室提供了規(guī)范的操作依據(jù)。